Cos'è reverse transcription pcr?

Reverse Transcription PCR (RT-PCR)

La Reverse Transcription PCR (RT-PCR) è una tecnica di laboratorio ampiamente utilizzata in biologia molecolare per rilevare e quantificare l'RNA. Combina la <a href="https://it.wikiwhat.page/kavramlar/reverse%20trascrizione">reverse trascrizione</a> dell'RNA in DNA complementare (cDNA) e l'amplificazione di sequenze specifiche di cDNA tramite <a href="https://it.wikiwhat.page/kavramlar/reazione%20a%20catena%20della%20polimerasi">PCR</a> (Reazione a Catena della Polimerasi).

Principi Fondamentali:

1. Reverse Trascrizione (RT): Un enzima chiamato <a href="https://it.wikiwhat.page/kavramlar/trascrittasi%20inversa">trascrittasi inversa</a> viene utilizzato per sintetizzare una copia di cDNA a partire da uno stampo di RNA. Questo passaggio è essenziale poiché la PCR standard può amplificare solo DNA. La trascrittasi inversa può essere ottenuta da retrovirus.

2. PCR: Il cDNA sintetizzato viene quindi utilizzato come stampo per la PCR. La PCR utilizza un'DNA polimerasi termo-stabile, primer specifici per la sequenza target, nucleotidi (dNTPs) e un ciclo termico per amplificare esponenzialmente la sequenza di DNA desiderata.

Tipi di RT-PCR:

• RT-PCR a endpoint (o RT-PCR convenzionale): Il prodotto PCR viene analizzato alla fine del ciclo, ad esempio tramite elettroforesi su gel. Fornisce informazioni qualitative o semi-quantitative sulla presenza dell'RNA. La quantità di prodotto alla fine della reazione non riflette necessariamente la quantità iniziale di RNA.

• Real-Time RT-PCR (o qRT-PCR): La quantità di DNA amplificato viene misurata in tempo reale durante la PCR. Utilizza coloranti fluorescenti o sonde specifiche per rilevare l'aumento del prodotto PCR ad ogni ciclo. Fornisce una quantificazione più precisa e affidabile dell'RNA di partenza.

Applicazioni:

La RT-PCR ha una vasta gamma di applicazioni, tra cui:

• Rilevamento di virus a RNA: Utilizzata per diagnosticare infezioni virali come COVID-19, influenza e HIV.
• Analisi dell'espressione genica: Permette di misurare i livelli di mRNA di specifici geni in diversi campioni o condizioni sperimentali.
• Diagnostica del cancro: Utilizzata per identificare marcatori tumorali a livello di RNA.
• Ricerca biologica: Strumento fondamentale per studiare la regolazione genica, la differenziazione cellulare e altri processi biologici.
• Validazione di dati microarray/RNA-seq: Conferma i risultati ottenuti con tecniche di screening genomico ad alta processività.

Vantaggi della RT-PCR:

• Alta sensibilità: Può rilevare anche piccole quantità di RNA.
• Alta specificità: Utilizzando primer specifici, è possibile amplificare solo la sequenza di RNA desiderata.
• Quantificazione accurata (qRT-PCR).
• Relativamente veloce e conveniente.

Limitazioni della RT-PCR:

• Suscettibilità alla contaminazione da RNAse (enzimi che degradano l'RNA).
• La qualità dell'RNA di partenza è critica.
• La progettazione dei primer è importante per evitare artefatti.
• La qRT-PCR richiede una calibrazione accurata e l'uso di controlli.